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细胞生物学检测
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细胞作为生物体结构和功能的基本单位,在药物研发、疾病研究时基本离不开在细胞水平上进行研究。细胞功能检测实验主要是以细胞为整体单位进行研究,细胞的生理过程,在一定程度上也是机体生命活动的反应。对体外培养的细胞进行不同的处理后检测其运动偏好、增殖、凋亡、活性等情况,或检测其生活周期内各项指标的变化,从而深入揭示细胞新陈代谢的具体机制。
      纽万生物能够为提供多种细胞培养、转染和功能检测服务。


细胞活力和细胞增殖测定

膜损伤检测-台盼蓝染色法


技术简介

    健康的活细胞细胞膜完整,透明不着色,能够着色的细胞均为不健康细胞。台盼蓝(Trypan Blue),也称二胺蓝(Diamine Blue)和加拉蓝(Niagra Blue),是一种用于选择性着色死细胞和即将死亡的细胞的重要染料。细胞死亡后,细胞膜通透性增加,台盘蓝可以进入细胞,导致细胞被染成蓝色。染色后的细胞进行细胞计数板中计数。

细胞活力(%)=(总细胞-着色细胞数)/总细胞*100%

 该方法是一种粗略检测细胞存活的方法,不能准确反应细胞活力的差异。另外,如果染色时间过长,正常的细胞也可以被染色,荧光结果的准确性。



实验方法


1.配置4%台盼蓝母液:称取4g台盼蓝,加少量蒸馏水研磨,加双蒸水至100ml,用滤纸过滤,4度保存。使用时。用PBS稀释至0.4%。

1.胰酶消化细胞,制备单细胞悬液,并作适当稀释。

2.染色:细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀(终浓度为 0.04%)。

3.计数:在三分钟内,镜下观察,死细胞被染成淡蓝色,而活细胞拒染呈无色透明。用计数板分别计数活细胞和死细胞。

4. 根据下式求细胞活力: 

活细胞率(%)= 活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×100  

注意事项:台盼蓝染细胞时,时间不宜过长。否则,部分活细胞也会着色,会干扰计数




代谢活性检测-CCK8法


技术简介:

      检测细胞群体的代谢活性也可以反应细胞增殖的情况,在细胞增殖过程中脱氢酶的活性会增加,通过添加四唑盐到细胞中可进行线粒体内酶代谢活性的测定,四唑盐作为脱氢酶的底物在代谢活跃的细胞环境中会逐渐减少,活细胞能将四唑盐还原成有色的甲瓒或甲瓒盐(Formazan),可通过分光光度计或酶标仪检测含染料培养基的吸光度值,从而衡量细胞的代谢活性,检测细胞的增殖情况。

     CCK-8(cell-counting kit-8)检测试剂盒是应用WST-8取代MTT被还原,WST-8是一种类似于MTT的化合物,在电子耦合试剂存在的情况下,可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan。WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。且WST-8相较XTT和MTS化学性状更稳定, 因此实验结果相对更加稳定。此外,WST-8相较MTT、XTT,线性范围相对宽,灵敏度更高。当细胞增殖得越多越快,则formazan产生量越多,颜色越深;反之,当内外因造成的细胞毒性越大,则颜色越浅。对于同样的细胞,颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。应用酶标仪测定吸光值并进行统计学计算便可以获得细胞增殖(活性)相关数据。


结果展示:

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DNA的合成的检测-EdU法检测


技术简介:

EdU (5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)也是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中,基于EdU与荧光染料的共轭反应可以进行高效快速的细胞增殖检测分析,可以有效地检测处于S期的细胞百分数,是一种新型的细胞增殖检测方法。与传统的免疫荧光染色(BrdU)检测方法相比,更简单,更快速,更准确。EdU只有BrdU抗体大小的1/500,在细胞内更容易扩散,不需要严格的样品变性(酸解、热解、酶解)处理,有效地避免了样品损伤,有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况,具有更高的灵敏度和更快的检测速度。

 EDU能够竞争性地渗入正在复制的DNA分子中,从而达到标记分裂细胞的目的。在进行体内实验,观察和研究移植细胞的分化、迁移、存活、分布的时候,EDU标记可以起到细胞示踪的作用。


结果展示:

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细胞凋亡检测


技术简介:

细胞凋亡(apoptosis)是指细胞在一定的生理或病理条件下,受内在遗传机制控制,按照自身程序主动性、生理性的死亡过程。在生物体进化、内环境的稳定以及发育过程中起着重要作用,具有重要生物学意义及复杂的分子生物学机制。

在生物学研究过程中常常需要检测细胞凋亡情况。目前至少有十数种检测细胞凋亡的方法,大致可分为基于细胞形态、生物学功能和生化标记三大类。每一方法都有其优缺点,需要根据实际情况选择适合的细胞凋亡检测方法。

基于细胞形态的方法:如电子显微镜观察法、细胞核形态染色法

基于生物学功能的方法:如Annexin-V/PI双染法、线粒体膜电位变化检测;

基于生化标记的方法:Caspase-3活性检测、DNA损伤检测、TUNEL法(DNA片断原位标记法)


结果展示:

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细胞周期检测

 技术简介:

   细胞周期(cell cycle)指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束的活动过程,细胞周期反应了细胞增殖速度。细胞周期是一个重要的检测参数,研究细胞周期变化的影响对于肿瘤的发展及药物研发有着重要的作用。细胞周期由G0/G1期、S期、G2期和M期组成:

(1)G0 期:细胞停止分裂,进入静止状态,DNA含量为二倍体;

(2)G1期:DNA 合成前期,细胞开始RNA和蛋白质的合成,但DNA含量仍保持二倍体;

(3)S 期:DNA 合成期 ,DNA含量介于二倍体和四倍体之间;

(4)G2 期:DNA 合成后期,DNA复制成四倍体;

(5)M期:细胞分裂期,DNA含量为四倍体。

PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料,能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合,其结合的量与DNA的含量成正比例关系,结合流式细胞仪,检测细胞内DNA荧光强度变化,得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态,判断细胞所处的细胞周期,同时可计算出各个期的百分含量。PI染色后, G0/G1期细胞的荧光强度为2N,那么G2/M期细胞的荧光强度的为4N,正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为2N-4N之间。


结果展示:

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细胞运动研究


Transwell迁移/侵袭实验


技术简介:

     Transwell小室的外形是可以放置在孔板中的小杯子,杯底层是一层具有通透性的聚碳酸酯膜,一般膜的孔径选择8μm的孔径。将Transwell小室放入培养板中,Transwel小室称为上室,培养板称为下室,上下室以聚碳酸酯膜隔离。将细胞接种在上室内,由于聚碳酸酯膜具有通透性,下层培养基液中的成分可以影响到上室内的细胞,从而可以研究下层培养基的成分对细胞生长、运动等的影响。另外,Transwel小室有不同的孔径和不同处理的聚碳酸 酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等方面的研究。


    与迁移实验不同的是,聚碳酸酯膜上室铺一层基质胶,用于模仿体内细胞外基质,细胞欲进入下室,需要先分泌基质金属蛋白酶(MMPS)将基质胶分解,放可以通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞两可以反应肿瘤细胞的侵袭能力。

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结果展示:


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细胞划痕实验

技术简介:

      细胞划痕是检测肿瘤细胞的运动特性的方法之一。细胞划痕实验(Wound Haling)是一种操作简单,经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。这种方法的原理是,当细胞长到融合成单层状态时,在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域,称为“划痕”,划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合,在一定程度上模拟了体内细胞迁移的过程,是研究细胞迁移的体外实验中简单的方法。


结果展示:

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